現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)的局限

傳統(tǒng)培養(yǎng)法：耗時(shí)長(zhǎng)（需數(shù)天），且易受其他細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)干擾。

VBNC 狀態(tài)：在低溫或營(yíng)養(yǎng)缺乏等不利條件下，創(chuàng)傷弧菌會(huì)進(jìn)入“活但不可培養(yǎng)”（VBNC）狀態(tài)，導(dǎo)致培養(yǎng)法出現(xiàn)假陰性。

常規(guī) PCR 技術(shù)：無(wú)法區(qū)分來(lái)自活菌和死菌的 DNA。在抗生素治療后，死菌 DNA 仍殘留體內(nèi)，導(dǎo)致 PCR 檢測(cè)呈假陽(yáng)性，無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)估治療效果。

模型設(shè)計(jì)：PMA-ddPCR 檢測(cè)方法

1. 技術(shù)路線

PMA 處理：利用光反應(yīng)性 DNA 結(jié)合染料 PMA 預(yù)處理樣本。PMA 能穿透死菌受損的細(xì)胞膜并與 DNA 結(jié)合，在光照下發(fā)生交聯(lián)，從而抑制其 PCR 擴(kuò)增；而活菌細(xì)胞膜完整，PMA 無(wú)法進(jìn)入，其 DNA 可正常擴(kuò)增。

ddPCR 檢測(cè)：將反應(yīng)體系分割成數(shù)萬(wàn)個(gè)微滴進(jìn)行獨(dú)立 PCR 擴(kuò)增，通過(guò)統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性微滴數(shù)量，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo) DNA 的絕對(duì)定量，無(wú)需依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2. 關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化

引物/探針：針對(duì)創(chuàng)傷弧菌溶血素 A（vvhA）基因設(shè)計(jì)，篩選出最佳引物對(duì) F6/R6 和探針 P6。

PMA 處理?xiàng)l件：確定最佳 PMA 濃度為 100 µM，避光孵育 15 分鐘后，使用 465 nm 藍(lán)光 LED 照射 10 分鐘。

ddPCR 條件：最佳引物/探針濃度分別為 1.0 µM 和 0.3 µM，最佳退火溫度為 60°C。

3.  菌株與樣本

菌株：使用 27 株細(xì)菌進(jìn)行特異性測(cè)試，包括 7 株創(chuàng)傷弧菌和 20 株其他細(xì)菌（如副溶血性弧菌、大腸桿菌等）。

樣本：使用純培養(yǎng)的創(chuàng)傷弧菌菌液和人工添加創(chuàng)傷弧菌的血漿樣本進(jìn)行靈敏度和性能評(píng)估。

4. 對(duì)比實(shí)驗(yàn)

將新建立的 PMA-ddPCR 方法與傳統(tǒng)的 PMA-qPCR 方法進(jìn)行平行對(duì)比，評(píng)估兩者在純培養(yǎng)和模擬臨床樣本中的檢測(cè)性能。

研究結(jié)論

成功建立了一種基于 vvhA 基因的 PMA-ddPCR 檢測(cè)方法，能夠準(zhǔn)確、靈敏地檢測(cè)樣本中的創(chuàng)傷弧菌活細(xì)胞，有效排除了死菌 DNA 的干擾，為創(chuàng)傷弧菌的精準(zhǔn)防控提供了有力的技術(shù)支撐。

文獻(xiàn)來(lái)源：HU L, FU Y, ZHANG S, et al. An assay combining droplet digital PCR with propidium monoazide treatment for the accurate detection of live cells of Vibrio vulnificus in plasma samples[J]. Frontiers in Microbiology, 2022, 13: 927285.