該研究旨在開發一種結合PMA-ddPCR（PMA-ddPCR）的新方法，以實現對高毒力肺炎克雷伯菌（hvKP）活菌的精準、靈敏檢測。

技術原理

核心在于結合PMA（Propidium monoazide）處理和ddPCR（Droplet digital PCR）兩種技術，以實現對活菌的特異性識別和絕對定量。

1、PMA（Propidium monoazide）處理

原理：PMA是一種光敏染料，能夠選擇性地進入細胞膜受損的死菌，并與DNA共價交聯。在后續PCR擴增中，被PMA結合的DNA無法被擴增。而活菌的細胞膜完整，PMA無法進入，其DNA可被正常擴增。

目的：通過PMA處理，可以有效抑制死菌DNA的擴增信號，從而確保后續檢測到的信號僅來源于活菌。

2、ddPCR（Droplet digital PCR）

原理：ddPCR是一種第三代PCR技術。它將PCR反應體系分割成數萬個獨立的微滴，每個微滴作為一個獨立的反應單元進行擴增。擴增結束后，通過檢測每個微滴的熒光信號（陽性或陰性），并應用泊松統計原理，直接計算出樣品中目標核酸的絕對拷貝數。

目的：相比傳統的qPCR，ddPCR無需依賴標準曲線，具有更高的靈敏度、精確度和抗干擾能力，尤其適用于復雜樣本中低濃度目標物的檢測。

3、靶基因選擇

研究選擇了peg-344基因作為檢測靶點。該基因是高毒力肺炎克雷伯菌（hvKP）的特異性標志物，能夠準確區分hvKP和經典肺炎克雷伯菌（cKP）。

實驗流程

整個實驗流程可分為方法建立、條件優化和性能評估三個階段。

1. 方法建立與條件優化

菌種準備：使用一株高毒力肺炎克雷伯菌（hvKP）作為目標菌株，并準備多種其他常見臨床病原菌用于特異性驗證。通過加熱（95℃, 20分鐘）制備死菌懸液。

PMA處理條件優化：

濃度優化：將PMA以不同濃度（0-120 μM）分別加入活菌和死菌懸液中，避光孵育后，用藍光（465 nm）照射。通過qPCR檢測，確定能完全抑制死菌DNA擴增且不影響活菌DNA擴增的最低PMA濃度。

光照時間優化：在確定的最佳PMA濃度下，設置不同的光照時間（0-40分鐘），以確定使PMA與DNA交聯反應達到飽和的最短光照時間。

引物與探針優化：針對peg-344基因設計多對引物和探針，通過qPCR篩選出擴增效率最高、特異性最好的一對，并進一步優化其在qPCR/ddPCR反應體系中的最佳濃度。

2. 性能評估

特異性驗證：使用優化后的PMA-ddPCR和PMA-qPCR方法，檢測hvKP以及其他7種非hvKP的常見病原菌（如大腸桿菌、銅綠假單胞菌等）的基因組DNA，驗證方法是否僅對hvKP產生陽性信號。

靈敏度與線性關系評估：

純培養體系：將活菌和死菌分別進行梯度稀釋，用PMA-ddPCR和PMA-qPCR進行檢測。通過線性回歸分析評估兩種方法的定量準確性（R²值），并通過Probit回歸分析計算對活菌和死菌的檢測限（LOD）。

模擬臨床樣本：將不同濃度的hvKP活菌和死菌加入健康人血漿中，模擬臨床感染樣本。重復上述檢測流程，評估兩種方法在復雜基質中的檢測性能。

3. 方法比較

在整個性能評估過程中，始終將新建立的PMA-ddPCR方法與傳統的PMA-qPCR方法進行平行比較，以凸顯ddPCR技術在靈敏度、準確性和抗干擾能力方面的優勢。

參考文獻：Li Z, Yang M, Duan H, Ji Y, Ping T, Zhang S, Ting C, Zhu P. Development and evaluation of a PMA - ddPCR for accurate detection of viable hypervirulent Klebsiella pneumoniae[J]. Journal of Microbiological Methods, 2026, 244: 107457.