首先用Cas9酶表達質粒（p51）轉化酵母細胞，并在YPD（E）固體板上用遺傳霉素進行篩選。然后將攜帶p51的酵母細胞在含有遺傳霉素的YPD（E）培養基中預培養，以便用gRNA質粒和線性供體進行第二次轉化。在YPD（E）固體營養板上，用p51和gRNA質粒的相關抗生素選擇Te轉化體。使用標準Taq聚合酶進行PCR確認后，將樹陽性菌落接種在YPD（E）培養基中，并在YPD培養基中轉移三次以丟失質粒。

參考文獻：Huo G, Foulquié-Moreno MR, Thevelein JM. Development of an industrial yeast strain for efficient production of 2,3-butanediol. Microb Cell Fact. 2022 Sep 29;21(1):199.