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正常肝組織；RAT

5×105cells/T25培養瓶

貼壁

上皮細胞樣

HIV-1、 HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌檢測陰性。

如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。1. 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加少量培養基終止消化。3. 按6-8ml/瓶補加培養基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。4. 將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培養過夜（或將細胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養基，培養過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

肝竇內皮細胞是肝臟非實質細胞中數目最多的細胞，約占肝非實質細胞總數的70%，在表型、功能上與普通毛細血管內皮細胞有較大差異。肝竇內皮細胞之間缺乏細胞間連接，細胞下基底膜物質很少，因此竇內皮通透性較高，有利于調節物質交換。 不同于肝細胞的自我復制，肝再生時新生LSECs主要來自肝內外其他細胞成分的分化替代，不少研究證實了肝再生時LSECs的骨髓源性替代。內皮祖細胞是參與這一過程的主要細胞成分。 窗孔是肝竇內皮細胞最具特征性的結構，從＜10nm至1～2μm不等，生理條件下由于窗孔結構的存在和缺乏內皮下完整基膜的結構，由肝竇內皮細胞構成的肝竇壁是全身毛細血管壁中唯一缺乏基膜的毛細血管，除竇內的血細胞外，血漿成分均能從窗孔進入Disse間隙，進行物質交換。

待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為例； 1．細胞凍存時，棄去培養基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，細胞變圓脫落后，加入2ml完全培養基終止消化，可使用血球計數板計數。 2．1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數量分配到凍存管中，注意凍存管做好標識。本公司按每個凍存管細胞數目大于1X106個細胞凍存。3．將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個小時以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。