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小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株

T25

腦微血管；內(nèi)皮細(xì)胞；BALB/c

上皮樣

細(xì)胞用表達(dá)多瘤病毒中T抗原的NTKmT逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)行轉(zhuǎn)化。 觀察到血管性血友病因子的表達(dá)及對(duì)熒光標(biāo)記的低密度脂蛋白（LDL）的攝入確認(rèn)其內(nèi)皮細(xì)胞特性。 bEnd.3 cells細(xì)胞可用細(xì)胞因子和脂多糖(LPS)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的Peyer's結(jié)高內(nèi)皮細(xì)胞受體， 粘膜血管定居因子(MAdCAM-1) 及內(nèi)皮細(xì)胞選擇素的表達(dá)。 腫瘤壞死因子 a (TNF alpha), 白介素 1 (IL-1)或 LPS的誘導(dǎo)作用是濃度及時(shí)間依賴的。 代數(shù)較早的bEnd.3細(xì)胞未受刺激時(shí)在表面表達(dá)MAdCAM-1，但過(guò)了30代后就不表達(dá)了。 細(xì)胞粘附分子 1 (ICAM-1)持續(xù)表達(dá)，并在LPS, IL-1 and TNF a處理后升高。 30代前血管細(xì)胞粘附分子 1 (VCAM-1)持續(xù)表達(dá)，但30代后不表達(dá)。 bEnd.3細(xì)胞中腫瘤壞死因子a (TNF alpha)可以誘導(dǎo)P-選擇素的表達(dá)，30代后更強(qiáng)。

DMEM+10%FBS+丙酮酸

1：2傳代

貼壁生長(zhǎng)

無(wú)血清細(xì)胞凍存液

如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。3. 按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。4. 將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；1．細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入2ml完全培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。2．1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。本公司按每個(gè)凍存管細(xì)胞數(shù)目大于1X106個(gè)細(xì)胞凍存。3．將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。