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人胚腎細胞

HIV-1、 HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌檢測陰性。

DMEM+10%FBS+1%P/S

roPak包裝細胞系可產(chǎn)生小鼠白血病病毒(MLV)異種顆粒(ProPak- x細胞;ATCC CRL-12007)或兩性顆粒(propaka細胞;ATCC CRL-12006和ATCC CRL-12479)。 人類胚胎腎系293基礎上建系，它們分泌由gag-pol和env蛋白組成的有缺陷(非傳染性)小鼠白血病病毒(MLV)顆粒。 在PA317細胞中不斷產(chǎn)生具有復制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒(RCR)的載體，在以propak為基礎的生產(chǎn)培養(yǎng)基中從未檢測到RCR。 通過嚴格的檢測，證實了以propak為基礎的生產(chǎn)細胞不具有復制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒(RCR)。 與pa317包裝的兩性載體相比，propak衍生的兩性載體能夠?qū)崿F(xiàn)更高的目標細胞轉(zhuǎn)導。

待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為例； 1．細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，細胞變圓脫落后，加入2ml完全培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。 2．1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中，注意凍存管做好標識。明舟生物按每個凍存管細胞數(shù)目大于1X106個細胞凍存。3．將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。3. 按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。4. 將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。