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人胚腎細(xì)胞

腎；以腺病毒5 DNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

上皮細(xì)胞

HIV-1、 HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌檢測(cè)陰性。

MEM+10%FBS+1%PS

293細(xì)胞是人胚胎腎細(xì)胞用剪切過(guò)的腺病毒5 DNA轉(zhuǎn)化得到。它們包含并表達(dá)腺病毒5的早期區(qū)段1。 它們包含并表達(dá)腺病毒5的早期區(qū)段1。 它們能互補(bǔ)E1失活的腺病毒突變株和載體，使其生長(zhǎng)。 在DNA轉(zhuǎn)染檢測(cè)中它們是特別有效的受體細(xì)胞。 對(duì)于大多數(shù)即使不是全部人腺病毒的生長(zhǎng)和溶菌斑測(cè)試，它們也表現(xiàn)很好。 這些細(xì)胞廣泛應(yīng)用于因缺失或代換E1序列引起的E1失活突變株和腺病毒載體的繁殖與滴定。 因此它們被用來(lái)構(gòu)建腺病毒載體。 用于構(gòu)建腺病毒載體最好使用低代數(shù)細(xì)胞，一般不超過(guò)40代。 對(duì)于保持這株細(xì)胞的優(yōu)良特性，正確的細(xì)胞培養(yǎng)方法十分重要。

待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例； 1．細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入2ml完全培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。 2．1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。明舟生物按每個(gè)凍存管細(xì)胞數(shù)目大于1X106個(gè)細(xì)胞凍存。3．將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。3. 按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。4. 將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。