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狗腎細(xì)胞

上皮細(xì)胞

MCM-0473：Super Tube細(xì)胞專用培養(yǎng)基

HIV-1、 HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌檢測(cè)陰性。

DMEM/F12(1:1): Ham＇s F12/DME Medium (DME H-16/F-12 50% Mixture w/o HEPES, with NEAA Medium) 優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%

貼壁生長(zhǎng)

基礎(chǔ)培養(yǎng)基+8%DMSO+20%FBS　

消化3-5分鐘。1:2。3天內(nèi)可長(zhǎng)滿。

從表觀正常的成年雌性可卡犬中建立了細(xì)胞株MDCK(ATCCCCL-34)，從中克隆建立了狗上皮樣細(xì)胞株SuperTube。當(dāng)維持高細(xì)胞濃度時(shí)，Supertube形成大量的小管(據(jù)報(bào)道，24孔板的每孔鋪7x105細(xì)胞，３天內(nèi)就能形成小管)。要形成小管，細(xì)胞需要每天兩次換液以提供足夠養(yǎng)分。與原始細(xì)胞株相比，SuperTube的c-AMP的檢測(cè)水平低得多，在forskolin刺激下讀出的腺苷環(huán)化酶水平也低；它的跨上皮抗性也比SuperDome(ATCCCRL-2286)和MDCK都低。在本庫(kù)通過支原體檢測(cè)。

待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例； 1．細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入2ml完全培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。 2．1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。明舟生物按每個(gè)凍存管細(xì)胞數(shù)目大于1X106個(gè)細(xì)胞凍存。3．將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。3. 按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。4. 將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。