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100μl

-20℃

KDM207：YPD瓊脂YPD Agar

MATa,trp1-901,leu2-3,112,ura3-52,his3-200,gal4Δ,gal80Δ,LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3,MEL1GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2,URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lacZ

培養(yǎng)基：YPDA 菌株類(lèi)別：酵母菌 培養(yǎng)條件：28℃，有氧，YPDA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：電轉(zhuǎn) 保存方式：30%甘油，-20℃ 基本應(yīng)用：酵母雙雜交

AH109菌株來(lái)源于PJ69-2A 酵母菌株，將lacZ報(bào)告基因引入PJ69-2A誕生了AH109，此菌株是Clontech公司開(kāi)發(fā)的GAL4系統(tǒng)酵母雙雜實(shí)驗(yàn)用菌株，MATa型，可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒或與MATα型酵母菌株Y187通過(guò)mating操作進(jìn)行蛋白互作驗(yàn)證或篩庫(kù)試驗(yàn)。Transformation marker為: trp1, leu2，報(bào)告基因?yàn)椋簂acZ, HIS3, ADE2, MEL1。AH109 -GAL4酵母雙雜系統(tǒng)需要兩種質(zhì)粒配套使用：PGBKT7和PGADT7。質(zhì)粒PGBKT7的篩選標(biāo)志為T(mén)RP1，用于表達(dá)DNA-BD(來(lái)自酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4N端1~ 174位氨基酸)與目標(biāo)蛋白(Bait)的融合蛋白；質(zhì)粒PGADT7的篩選標(biāo)志為L(zhǎng)EU，用于表達(dá)AD(GAL4 C端768 ~881 位氨基酸)與目標(biāo)蛋白（Prey）的融合蛋白。GAL4系統(tǒng)原理：一個(gè)完整的酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4可分為功能上相互獨(dú)立的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：位于N端1 ~ 174位氨基酸區(qū)段的DNA結(jié)合域（DNA-BD）和位于C端768 ~881 位氨基酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄激活域(AD)。DNA-BD能夠識(shí)別GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS，并與之結(jié)合。而AD可以啟動(dòng)UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。BD和AD單獨(dú)存在不能激活轉(zhuǎn)錄，但當(dāng)二者接近時(shí)，則呈現(xiàn)完整的GAL4活性，使含有UAS的啟動(dòng)子下游基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。正常條件下，BD不與AD結(jié)合，將要檢測(cè)的蛋白質(zhì)分別與BD和AD融合，形成 bait 融合蛋白（bait -BD）和 prey 融合蛋白（prey-AD），如果 bait 和 prey發(fā)生相互作用，就會(huì)促使 BD 和 AD 的相互接近，形成完整的GAL4，從而激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。AH109有四個(gè)報(bào)告基因：lacZ, HIS3, ADE2, MEL1，分別由三種不同的啟動(dòng)子（GAL1，GAL2，MEL1）啟動(dòng)，這三種啟動(dòng)子只有GAL4識(shí)別的17bp核心區(qū)相同，其余部分均不同，大大降低了酵母雙雜假陽(yáng)性發(fā)生的概率。