利用特異性引物對(duì)（ORF N F和ORF R）對(duì)釀酒酵母基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得TeN端截?cái)嗟腎LV基因，將截?cái)嗟幕驈?fù)制到p413GPD的BamHI和XhoI位點(diǎn)之間獲得了p413GPD-ILV2ΔN54,p414GPD-ILV5ΔN48和

p416GPD-ILV3ΔN19。利用目標(biāo)特異性引物對(duì)從枯草芽孢桿菌中獲得開(kāi)放閱讀框alsS(B)，從乳酸乳球菌中獲得開(kāi)放閱讀框 alsS(L)。為了獲得單基因表達(dá)質(zhì)粒，將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到p413GPD或p413ADH質(zhì)粒中，獲得了 p413GPD-alsS(L) 和 p413ADH-alsS(B)質(zhì)粒。

參考文獻(xiàn)：Park SH, Hahn JS. Development of an efficient cytosolic isobutanol production pathway in Saccharomyces cerevisiae by optimizing copy numbers and expression of the pathway genes based on the toxic effect of α-acetolactate. Sci Rep. 2019 Mar 8;9(1):3996.